形質転換・インサートチェック

 

形質転換

 プラスミドとインサートDNAのライゲーション反応を終えた後は、これらをコンピテントセルに入れ、形質転換(トランスフォーメーション)を行なう。

 難しい事ではなく、ただ大腸菌の中にプレスミドを入れて培養するだけである。

 大腸菌が増殖すると、その中にインサートされた目的DNAも増える。これが形質転換である。

 

インサートチェック

 ライゲーション産物を用いて形質転換された大腸菌は、すべてがきちんとインサートDNAの入ったプラスミドを持っているわけではない。セルフライゲーションしたプラスミドであったり、インサートやベクターDNAを調製する際に予想外の変異や欠失が起きてしまっていたり、向きが逆に入ってしまっている、など。そこで、目的のインサートDNAがちゃんと入っているかを確認するのがインサートチェックである。

 インサートチェックには、主に3つの方式がある。

 

l         プラスミドを精製し、制限酵素処理やシークエンスなどにより、インサートを確認:プラスミドを精製した後、インサートDNAの全長もしくは部分長をベクターから切り出すような制限酵素処理をして、切り出されたDNAの長さを確認する方法。制限酵素の組み合わせにより向きも確認できる。

l         カラーセレクションで判定する:大腸菌のラクトースの分解に関与する遺伝子群を含むオペロン(ラクトースオペロン)を利用したシステム。

l         PCRを行なう:PCRに用いるプライマーは、プラスミドベクターのクローニングサイトの両端の配列を用いるのが簡単である。確実を期すならば、目的断片の中の配列とクローニングサイトのプライマーとの間で増幅を行う方が良い。この場合、クローニングサイトのプライマーは2種あるので1サンプルあたり2反応行なわなければならないが、サブクローニングサイトされた方向も知ることができる。

 

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